微课堂禽流感检测方法整理
背景：年政府招标文件“动物疫情监测与防治经费项目”中，中科基因连中4包。要求按《农业农村部办公厅关于印发〈年国家动物疫病监测与流行病学调查计划〉的通知》文件内容，开展相关病种监测工作。包括非洲猪瘟、禽流感、口蹄疫、包虫病、血吸虫病等病种病原学检测，布鲁氏菌病、马传贫、马鼻疽血清学检测，完成检测任务、上报检测结果。
禽流感（Avianinfluenza）是由A型流感病毒引起的一种人兽共患病，可引起禽类呼吸系统疾病、产蛋下降乃至急性致死。该病毒（Avianinfluenzavirus）亚型多、变异频繁，可分为高致病性和低致病性毒株两类。其中，高致病性禽流感被世界卫生组织列为法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。禽流感的诊断主要依靠临床诊断和实验室诊断技术，常用的实验室诊断方法有病毒的分离鉴定；血凝及血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验、琼脂糖扩散试验、酶联免疫吸附试验等血清学诊断方法；以及RT-PCR、荧光RT-PCR等分子生物学诊断技术。《年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》中要求对于禽流感病原检测是采集病料用RT-PCR或实时RT-PCR方法，国家禽流感参考实验室病毒分离鉴定采用鸡胚接种方法进行检测。而对于抗体检测是采集血清用血凝抑制试验（HI）。文件强调在我国25个省（自治区、直辖市）对禽类和高风险区域环境样品进行采样监测。重点监测H5、H7亚型流感病毒变异及流行状况，评估家禽免疫抗体水平。一
检测标准（现行）
表1禽流感检测标准
表2禽流感诊断标准中的实验室检测方法
二
样本的采集
1.病料的采集
死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品；活禽病料应包括气管或泄殖腔拭子；小珍禽可采集新鲜粪便。2.病料的保存
病料应放在含有抗菌素的pH值7.0～7.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）内（无PBS可用25%～50%的甘油盐水）。注意粪便和泄殖腔拭子缓冲液中抗生素浓度应提高5倍，可在2~8℃低温保存（－70℃贮存最好）并于24小时内送至检测实验室。3.病料的处理
将棉拭子捻动出的液体用含抗生素的等渗PBS溶液稀释配成悬液，离心后取上清液作为接种材料。三
病毒分离鉴定
该法是病原学诊断的金标准，操作程序繁琐，耗时耗力，高致病性禽流感病毒要在生物安全水平三级（ABSL-3）及以上的实验室进行，低致病性毒株需要在生物安全水平二级（ABSL-2）及以上的实验室进行。在病毒分离后可进行禽流感病毒致病性测定，通过观察接种动物致死量以及接种缺乏胰蛋白酶的细胞上的生长情况来判断是否为高致病性禽流感病毒，但是注意致病性测定的试验应在具有高度生物安生性的实验室中进行。1.鸡胚接种
鸡胚是流感病毒初次分离和大量增殖的主要材料。将采集样品进行处理，经尿囊腔途径接种9日龄～11日龄SPF鸡胚。无菌收取培养后的死胚及鸡胚尿囊液，进行血凝/血凝抑制试验、琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验进一步验证。2.细胞培养
原代猴肾细胞和MDCK细胞是流感病毒培养最常用的两种细胞。接种细胞后观察细胞病变，当75%~%的细胞出现病变时进行收获。冻融处理1~2次后收获，血凝/血凝抑制试验、琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验进一步验证。四
分子学检测技术
1.荧光RT-PCR
目前，实时荧光RT-PCR已成为我国标准化的禽流感病毒检测和分型技术。通用型检测系统可用于检测所有16个亚型的A型流感病毒，而标准中也针对H5、H7、H9三个亚型制定了相应的检测技术。实时荧光RT-PCR因其快速、敏感和特异，在禽流感病毒的检测中发挥着巨大作用。2.RT-PCR
常规RT-PCR是目前发展最成熟的分子诊断技术，显著缩短了检测禽流感病毒的时间，为禽流感的早期快速诊断提供了更敏感的方法。针对禽流感的M、NP、HA和NA基因设计通用检测引物，同时，也针对HA和NA设计引物可检测禽流感病毒H5、H7和H9以及N1和N2亚型。表3禽流感病毒RT-PCR检测引物
3.恒温扩增技术（NASBA）
NASBA（Nucleicacidsequence-basedamplification，依赖核酸序列的扩增技术）是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶（反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖核酸聚合酶）和两条寡核苷酸引物。根据已杂交上的钌标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应来判定结果。表4禽流感病毒恒温扩增技术引物
五
血清学检测技术
1.血凝/血凝抑制试验（HA/HI）
当病毒样品接种的鸡胚尿囊液具有血凝活性时，注意应排除血凝活性是否由新城疫、减蛋综合征等病毒引起，同时要注意是否有禽流感病毒与其他病毒混合感染。采集血清样品，采用血凝抑制试验（HI）进行H5、H7亚型禽流感抗体检测来评估免疫效果，免疫21天后HI抗体效价≥24为免疫合格。血凝素亚型鉴定也可采用HA-HI试验方法，用禽流感病毒16种血凝素（H1～H16）亚型分型血清对样品进行病毒亚型鉴定。血凝素亚型鉴定要求有全套的禽流感病毒血凝素分型血清，一般在国家指定的实验室进行。（1）血凝（HA）试验
用于检测病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）的血凝活性。观察结果时对照孔红细胞将成明显钮扣状沉到孔底。将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。（2）血凝抑制（HI）试验
根据以上血凝试验结果配制4HAU的病毒抗原用于试验，同时，为了确保血凝抑制试验时使用抗原的活性，有必要对8HAU的病毒抗原进行血凝效价的重测定。以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。2.琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验
图1琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验结果
可利用该法检测A型流感病毒是否存在。如上图位置所示，用微量移液器吸取抗原悬液滴入中间孔⑦号孔，标准阳性血清分别加入①和④孔，被检血清按编号顺序分别加入②，③，⑤，⑥号孔。静止反应后观察结果。结果如上图所示，我们可根据上图出现的几种不同的实验结果进行相应的判定。3.间接ELISA
采用包被抗原的酶标板检测被检血清中的抗体。该法具有快速、敏感度高的特点，适用于大批量样品的血清学检查，该法也是OIE指定的用于国际贸易的检测技术。六
中科基因检测能力
参考资料：
《动物疫病诊断技术——理论与应用》
《GB/T-高致病性禽流感诊断技术》
《GB/T-禽流感病毒NASBA检测方法》
《NY/T-禽流感病毒RT-PCR检测方法》
OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》
《年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》
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