微课堂布鲁氏菌病诊断技术整理

背景：年政府招标文件“动物疫情监测与防治经费项目”中，中科基因连中4包。要求按《农业农村部办公厅关于印发〈年国家动物疫病监测与流行病学调查计划〉的通知》文件内容，开展相关病种监测工作。包括非洲猪瘟、禽流感、口蹄疫、包虫病、血吸虫病等病种病原学检测，布鲁氏菌病、马传贫、马鼻疽血清学检测，完成检测任务、上报检测结果。

多种动物对布鲁氏菌易感，羊、牛、猪的易感性最强。母畜比公畜易感，成年畜比幼年畜易感。动物的易感性随着性成熟年龄接近而增高，在母畜中第一次妊娠母畜发病较多。患病和带菌动物是主要传染源，尤其是感染的妊娠母畜。在流产或分娩时将大量的布鲁氏菌随着胎儿、胎水和胎衣排出，流产后的阴道分泌物和乳汁中都含有布鲁氏菌。布鲁氏菌病的传播途径主要是消化道，也可通过皮肤、结膜、交配等感染，蜱的叮咬可传播本病。布鲁氏菌病呈现明显的接触传播特征，通过直接接触或间接接触均可造成传播，在牧区或农牧区多发。疾病的发生不具有明显的季节性，在有感染的群体内呈扩散传播特点。一般为散发，羊种布鲁氏菌病可呈地方流行性发生。

一

诊断标准

表1布鲁氏菌病诊断标准（现行）

二

临床诊断

（一）临床症状潜伏期一般为用14~d。显著症状是妇娠母畜发生流产，流产后可能发生胎衣滞留和子宫内膜炎，从阴道流出污秽不洁、恶臭的分泌物。新发病的畜群流产较多；老疫区畜群发生流产的较少，但发生子宫内膜炎、乳房炎、关节炎、局部脓肿、胎衣滞留、久配不孕的较多。公畜往往发生睾丸炎、附睾炎和关节炎。（二）病理变化主要病变为妊娠或流产母畜子宫内膜的膜和胎衣的炎性浸润、渗出及坏死，有的可见关节炎。胎儿主要呈败血症病变，浆膜和黏膜有出血点和出血斑，皮下结缔组织发生浆液性、出血性炎症。组织学检查可见脾、淋巴结、肝、肾等器官形成特征性肉芽肿。

三

实验室检测

表2布鲁氏菌病诊断标准中的实验室检测方法

（一）布鲁氏菌病病原学检测1.涂片染色镜检将组织或生物液体进行涂片，加热或酒精固定后，用改良萋-尼氏方法染色后镜检，布鲁氏菌菌体染成红色球杆菌或短棒状杆菌，背景为蓝色。革兰氏染色呈阴性，一般不发生两极着染。2.细菌分离培养对于采集的动物组织及疑似感染病料进行处理并接种于培养基，培养后，布鲁氏菌菌落呈圆形，直径1mm~2mm，边缘光滑。透射光下，菌落呈浅黄色有光泽，半透明。从上面看，菌落微隆起，灰白色。随时间推移，菌落变大，颜色变暗。吸取结晶紫染液，浸没菌落15s~20s，光滑型菌落不着色，变异菌落被染成紫色或红色。3.细菌鉴定对分离后的细菌进行CO2需求试验，H2S试验，氧化酶，脲酶试验，对硫堇、复红染料的敏感性试验，特异性血清凝集反应试验，噬菌体溶解试验，根据反应结果对不同种属的布鲁氏菌进行判定，判定标准参照GB/T-动物布鲁氏菌病诊断技术。4.Bruce—ladder检测使用8对引物进行多重PCR，可以鉴别牛种、羊种、绵羊附睾种、猪种、犬种、沙林鼠种、海洋种、田鼠种、B.inopinata布鲁氏菌和S19疫苗、RB51疫苗、Rev1疫苗菌株。

图1布鲁氏菌种PCR扩增图谱

5.PCR《NY/T-奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术》规定了奶牛的套式PCR技术，设计2对特异性引物，2次扩增反应，电泳时样品出现一条bp的条带，判为阳性。表3用于布鲁氏菌套式PCR检测的引物6.环介导恒温扩增（LAMP）检测根据布鲁氏菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，在特异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，产生副产物（焦磷酸镁），形成乳白色沉淀，可观查判断结果；另加入核酸显色液，可观察颜色变化判定结果。样品反应管液体呈绿色，结果为初筛阳性，需进一步按照GB/T-中的传统方法进行确认；如果样品反应管呈橙色，结果判定为阴性。7.荧光PCR采集血液、痰液、组织、土壤或粉末以及物体表面的样本，经处理和增菌后，提取DNA进行荧光PCR反应。表4用于布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测的引物和探针8.上转发光技术上转发光技术利用稀土元素合成的上转发光材料（up-convertingphosphor,UCP）晶体颗粒作为生物示踪物，进而与免疫层析技术、生物传感技术相结合，发展而成的新型高敏感生物检测技术。UCP颗粒具有独特的上转发光现象，即可由低能红外光激发，发射高能可见光，据此被称为上转发光材料。UCP颗粒这种独特的发光特性，使得以其作为生物示踪物的上转发光技术在检测中可以排除外界的信号干扰，因而具有更高的检测敏感性与可靠性。（二）布鲁氏菌病血清学检测1．虎红平板凝集试验（RBT）虎红平板凝集试验是一种简单的斑点试验，是国际贸易指定试验。用抗原性良好的布鲁氏菌菌株，接种于适宜培养基培养，收获菌体，经加热灭活，离心后用虎红染液染色，悬浮于乳酸缓冲液中制成虎红平板凝集试验抗原。此方法灵敏度高，操作方便，检测快速且价格便宜，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。2．乳牛全乳环状试验（MRT）全乳环状试验方法可用来筛查监测泌乳期牛群的布鲁氏菌病。当乳汁中存在布病抗体时，与布氏杆菌病全乳环状抗原结合，红色的抗原抗体复合物就会转移至乳脂层，形成紫红色的乳脂环。检测大型牛群（超过头泌乳牛）时，本试验的敏感性会降低。可调整MRT试验，以弥补因稀释大型牛群的大量奶样而带来的影响。调整样品的方法如下：牛群数量头时，用1mL奶；~头时，用2mL奶样；~头时，用3mL奶样。以下情况可导致假阳性反应：供奶的牛免疫接种不到4个月；奶样中含有异常乳（如初乳）；供奶的牛患乳房炎。在小型牛场，上述问题对试验结果造成的影响较大，不建议采用MRT。3．试管凝集试验（SAT）布鲁氏菌凝集抗原和布鲁氏菌抗体，在电解质参与下，在试管内相互凝集形成肉眼可见的凝集小块。试管凝集试验是布病的确诊试验之一，准确性高，可以定量测定抗体水平，具有较高的特异性。但是此方法操作繁琐，反应时间长，不适用于现场疫情快速诊断。4．补体结合试验（CFT）补体结合试验通过反应系统（抗原与抗体）与指示系统（绵羊红细胞与溶血素）争夺补体系统来实现。当待测样本中有布鲁氏菌抗体时，抗原抗体发生反应后可以结合补体，加入指示系统（绵羊红细胞与溶血素），由于体系中没有游离的补体，就不能与指示系统发生反应，不出现溶血现象，即阳性试验无溶血现象。补体结合试验是国际贸易指定试验，灵敏性高，特异性强，初筛阳性或者SAT诊断可疑的均可用CFT进行确诊。但是由于猪补体能够干扰豚鼠补体，导致实验敏感性下降38%左右，因此不适用于猪布病诊断。5．酶联免疫吸附试验（ELISA）目前用于布病检测的ELISA有间接ELISA（iELISA）和竞争ELISA（cELISA）两种。6．琼脂扩散试验（AGID）绵羊种布鲁氏菌病可用琼脂扩散试验来检测。

中科基因实验室布鲁氏菌检测能力

表5中科基因布鲁氏菌病检测能力

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