基因编辑技术在血友病治疗中的应用

之前在文章“AAV载体介导血友病基因治疗的研究进展与挑战”中介绍了AAV载体介导血友病基因治疗在临床研究中取得了一定的进展。AAV基因治疗血友病的原理是将factorVIII（FVIII）或者factorIX（FIX）基因递送至体内，表达有活性的凝血因子从而达到治疗的目的。然而，由于包含外源基因的AAV基因组在细胞内通常以附加体形式存在，随着肝细胞的更新AAV基因组会逐渐丢失，尽管在成人体内速度比较慢，但是治疗基因的表达始终是有限期的。而基因编辑技术是在基因组水平纠正变异基因或者靶向整合正确基因，有望实现此类单基因遗传病的永久治愈。

基因组敲入涉及有、无核酸酶两种方案。核酸酶能够在基因组靶位点产生双链切口（DSB），所以整合效率更高，而它的缺点在于脱靶引起的变异风险。目前使用的核酸酶有，锌指核酸酶（ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN），成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/Cas蛋白系统。核酸酶诱导的DSB通过两种主要的细胞修复系统进行修复：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR/HR）。NHEJ途径是将双链DNA的两个末端直接连接，在这个过程中，DSB位点会产生小的插入和删除（indel），DSB修复中80%是以这种模式完成的；HR是以外源DNA或姐妹染色体作为模板进行修复，所以它是一种高保真的修复系统。因此，HR更多地被用于纠正治疗单基因突变遗传病，例如血友病。下面我们就来介绍一下采用基因编辑技术治疗血友病的现状。

图1.基因编辑策略

1.体内基因编辑

治疗血友病的最理想方法就是在基因组水平纠正或者替换突变的凝血因子基因。Li等构建了两种肝脏高趋向性的AAV，一种编码ZFN，另一种携带同源臂和正确的FIXcDNA，将两种AAV同时递送到人源化新生血友病小鼠体内，证明了HDR介导的体内矫正是可行的。他们的研究非常有意义，因为这是第一次成功利用核酸酶介导体内基因编辑的尝试，结果表明AAV体内递送核酸酶（ZFN）可以高效介导DSB的产生（34-47%）。尽管腹腔注射AAV到2日龄小鼠体内，肝组织靶向HDR效率仅为1-3%，但足以在B型血友病小鼠模型中恢复止血。随后的部分肝切除实验表明，治疗性FIX可稳定表达长达30周，表明基因组修饰可以克服常规基因治疗的局限性，适用于肝组织快速生长的婴幼儿。之后，Anguela等证明了上述方法应用在成年小鼠体内同样有效。AAV-ZFN和AAV供体DNA静脉注射到8周龄的人源化小鼠体内，循环FIX恢复到正常水平的23%，且持续时间达60周以上。同一研究小组，将FVIII和FIX基因靶向整合到小鼠肝脏内源性白蛋白（Alb）基因座中，能够在血友病A和血友病B小鼠体内持续表达治疗水平的活性凝血因子。文中提到一点值得

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